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Jun 29, 2023

Perfiles genómicos y transcriptómicos de colonias de fénix.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13726 (2022) Cita este artículo 694 Accesos 1 Citas 4 Detalles de Altmetric Metrics Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa responsable de

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13726 (2022) Citar este artículo

694 Accesos

1 Citas

4 altmétrico

Detalles de métricas

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa responsable de numerosas infecciones humanas. Anteriormente, se identificaron nuevas variantes tolerantes a los antibióticos conocidas como colonias de fénix, así como variantes similares a colonias viables pero no cultivables (VBNC), en respuesta a altas concentraciones de aminoglucósidos. En este estudio, los mecanismos detrás de la aparición de colonias fénix y colonias similares a VBNC se exploraron más a fondo utilizando tanto la secuenciación del genoma completo como la secuenciación de ARN. Se descubrió que las colonias de Phoenix tenían un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen PA4673, que se predice que codifica una proteína de unión a GTP. No se identificaron SNP dentro de colonias similares a VBNC en comparación con la población fundadora. La secuenciación de ARN no detectó cambios en la expresión de PA4673, pero reveló múltiples genes expresados ​​diferencialmente que pueden desempeñar un papel en la aparición de colonias de fénix. Uno de estos genes expresados ​​diferencialmente, PA3626, codifica una pseudouridina sintasa de ARNt que, cuando se desactiva, provoca una falta total de colonias de fénix. Aunque no está claro de inmediato si los genes identificados en este estudio pueden tener interacciones que aún no han sido reconocidas, pueden contribuir a la comprensión de cómo las colonias de fénix pueden emerger y sobrevivir en presencia de exposición a antibióticos.

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa que se encuentra en todo el entorno natural. Como patógeno oportunista, se asocia más comúnmente con infecciones por fibrosis quística (FQ), pero también puede residir en heridas crónicas e infecciones del sitio posquirúrgico1,2,3. P. aeruginosa utiliza la formación de biopelículas, células persistentes y el desarrollo de mecanismos de resistencia a múltiples fármacos para evadir la destrucción por agentes antimicrobianos4,5,6,7. Además de estos mecanismos de tolerancia y resistencia a los antimicrobianos, se ha descubierto que P. aeruginosa se adapta rápidamente a su entorno dentro del contexto de la infección, lo que genera preocupaciones sobre la eficacia reducida de los agentes antimicrobianos para erradicar P. aeruginosa8.

En un estudio anterior, nuestro laboratorio identificó un nuevo fenotipo de P. aeruginosa tolerante a aminoglucósidos, al que hemos denominado colonias de fénix. Las colonias de Phoenix pueden sobrevivir y prosperar en un ambiente cargado de antibióticos. Sin embargo, una vez eliminadas del entorno antibiótico inicial, las colonias de fénix vuelven a un nivel de susceptibilidad a los antibióticos de tipo salvaje9. Las colonias de Phoenix se diferencian de la tolerancia tradicional en que pueden mantener altos niveles de actividad metabólica durante la exposición a los antibióticos, mientras que la tolerancia tradicional suele ser el resultado de un crecimiento lento o una disminución del metabolismo. Además, las colonias de fénix se diferencian tanto de las colonias heterorresistentes como de las células persistentes. Utilizando perfiles de análisis de población, un método tradicional para identificar la heterorresistencia, se descubrió que las colonias de fénix eran homogéneamente susceptibles a los antibióticos después del aislamiento. También se midió que la concentración de tobramicina en la región de aparición de las colonias de fénix era aproximadamente diez veces la concentración mínima inhibitoria (CMI), lo que evitaría el despertar persistente de las células en el momento en que aparecen las colonias de fénix10. En el mismo estudio, identificamos un fenotipo adicional que era similar al fenotipo de colonias viables pero no cultivables (VBNCs11); sin embargo, estas colonias "similares a VBNC" pudieron crecer en el entorno antibiótico inicial pero no pudieron cultivarse. en caso contrario, incluir cultivos que contengan el mismo antibiótico9. Si bien actualmente se desconoce la importancia de estos fenotipos en un entorno clínico, es posible que las colonias de fénix o colonias similares a VBNC puedan provocar infecciones crónicas o recurrentes, similares a las de las células persistentes7. Además, si bien parece que las colonias de fénix solo emergen en presencia de aminoglucósidos9, se desconocen los mecanismos moleculares y genéticos que conducen a la aparición de colonias de fénix y similares a VBNC. Comprender las alteraciones genéticas en estas células o las alteraciones en la expresión genética puede permitir mejores opciones preventivas o de tratamiento en el manejo de infecciones crónicas o recurrentes.

En este estudio, utilizamos la secuenciación del genoma completo (WGS) de colonias de fénix y colonias similares a VBNC para identificar un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) que puede estar asociado con la aparición de colonias de fénix en presencia de altas concentraciones de aminoglucósidos. Además, se realizó la secuenciación de ARN en colonias de fénix y en colonias similares a VBNC y se identificaron genes expresados ​​diferencialmente (DEG) que podrían explicar los fenotipos de adaptación a los antibióticos representados tanto por las colonias de fénix como por las colonias de tipo VBNC.

Como se mostró anteriormente9, se cultivaron colonias variantes resistentes y tolerantes a los antibióticos exponiendo un césped de biopelícula PAO1 de P. aeruginosa a altas concentraciones de tobramicina mediante exposición utilizando una perla de CaSO4 que contenía 1 mg de tobramicina (Fig. 1). Se aisló ADN genómico de colonias de fénix, colonias similares a VBNC y la población fundadora de P. aeruginosa PAO1. La secuenciación del genoma completo (WGS) se realizó utilizando un secuenciador Nanopore MinION y las lecturas se asignaron al genoma de referencia PAO1. Las lecturas mapeadas se analizaron para detectar la presencia de SNP, así como inserciones o eliminaciones (indeles). Solo la muestra de la colonia Phoenix codificó algún SNP en comparación con el genoma de referencia PAO1 y ninguna muestra (colonia Phoenix, colonia similar a VBNC o colonia de control) contenía indeles. La variante única de guanina a timina (GCF_000006765.1:c.353G>T) se produjo dentro del gen PA4673, una proteína citosólica hipotética, para producir un cambio de aminoácido de serina a isoleucina (S118I).

Aislamiento de variantes de colonias de P. aeruginosa para analizar el genoma y la expresión génica. (A) Diagrama de los métodos experimentales para obtener la emergencia de colonias variantes para P. aeruginosa PAO1 con tobramicina. (B) Las imágenes del sistema de imágenes in vitro (IVIS) de placas representativas de colonias de fénix muestran áreas de muestreo bacteriano. Setenta y dos horas después de la colocación de las perlas de tobramicina, se tomaron muestras del borde de la zona de limpieza (ZOC), donde se esperaba que surgieran colonias de fénix al día siguiente después de una incubación continua. Noventa y seis horas después de la colocación de las perlas de tobramicina, se tomaron muestras de colonias de fénix, colonias similares a VBNC y el césped del fondo exterior. Además, se tomaron muestras de céspedes bacterianos cultivados durante 72 h que no habían sido expuestos a antibióticos para usarse como controles comparativos. El rojo indica altos niveles de actividad metabólica, el azul indica niveles bajos de actividad metabólica y el negro indica ausencia de actividad metabólica.

Para determinar el impacto del polimorfismo S118I en PA4673, se realizó un modelado de proteínas de novo utilizando Phyre212. Los modelos estructurales tanto de las proteínas de tipo salvaje como de las mutantes muestran un cambio en la estructura secundaria de la proteína mutante, específicamente, la formación de una lámina β predicha en el sitio de la mutación, que se encuentra en una cara expuesta de la proteína y es También se predice que tendrá una hidrofobicidad alterada en la región mutada (Fig. 2). Esta modificación puede conducir a la alteración de un sitio de unión o de la función de la proteína. La identificación de dominios funcionales en ambas isoformas de PA4673 predijo dominios entre AA001 y AA363, lo que indica que probablemente funcionen como proteínas de unión a GTP, ya que se alinean con un 100 % de confianza con la proteína de unión a GTP YchF de Schizosaccharomyces pombe13,14. Además, se analizó el mutante del transposón PA4673 de la biblioteca de mutantes de transposones de P. aeruginosa de Colin Manoil15 para detectar la aparición de colonias de fénix. No se observaron diferencias significativas entre P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje y el mutante del transposón PA4673 (p = 0,71).

Estructura proteica de PA4673 de tipo salvaje y mutante. Las estructuras de proteínas se derivaron de las secuencias de aminoácidos de PA4673 de tipo salvaje y mutante usando Phyre2. El cuadro rojo indica el cambio estructural provocado por el SNP. La identificación del dominio funcional en ambas isoformas de PA4673 indica que probablemente funcionen como proteínas de unión a GTP. Como el SNP provoca un cambio de aminoácido en la porción exterior de la estructura proteica prevista, puede provocar una alteración de un sitio de unión o de la función proteica.

Debido a la falta de candidatos genéticos claros para promover estados de colonia alternativos, se utilizó un enfoque transcriptómico para definir los cambios en la regulación genética asociados con cada tipo de colonia alternativa. Se aisló ARN de muestras en el borde de la ZOC a las 72 h, de poblaciones de colonias múltiples a las 96 h (colonias Phoenix, colonias similares a VBNC y el césped de fondo exterior) y de un césped no expuesto de 72 h como control, y preparado para secuenciación basada en Illumina (Fig. 1). Aunque las colonias de fénix se aislaron 96 h después de la exposición a los antibióticos, solo habían estado creciendo durante aproximadamente 24 h como colonias distintas dentro de la ZOC y todavía estaban metabólicamente activas (Fig. 1), lo que indica que todavía estaban empleando activamente métodos para sobrevivir a la exposición a los antibióticos. .

Se realizó la expresión genética diferencial de colonias de fénix o colonias similares a VBNC para definir perfiles transcripcionales que distinguen cada fenotipo. Primero, se generó un gráfico de escala multidimensional (MDS) utilizando la expresión de todos los genes para examinar las relaciones entre todas las muestras (Fig. 3). Este gráfico muestra una agrupación compacta entre réplicas biológicas de cada fenotipo de colonia con la excepción de las poblaciones del borde exterior de 96 h, mientras que el borde del grupo ZOC, el control y las muestras de césped de fondo exterior se agruparon por sí solas. Las colonias de Phoenix y las colonias similares a VBNC se superponen en gran medida, lo que indica perfiles transcriptómicos muy similares. La expresión genética diferencial entre las colonias de césped de control y de fénix, así como las colonias de césped de control y similares a VBNC, identificó 63 y 90 genes con abundancia de transcripción significativamente diferente, respectivamente (> 2 veces el cambio, valor de p corregido < 0,05, Fig. 4). Estos genes se dividieron en 40 genes regulados negativamente y 23 genes regulados positivamente al comparar las colonias de fénix con el césped de control, y 56 genes regulados negativamente y 34 genes regulados positivamente para las colonias similares a VBNC en comparación con el control (Tablas 1, 2). . No hubo expresión diferencial significativa de PA4673, el gen que contiene el SNP de la colonia Phoenix. Los DEG se enviaron para el análisis de DAVID, KEGG y Gene Ontology, pero no se identificó ninguna correlación significativa.

Gráfico de escala multidimensional (MDS) que muestra la agrupación de aislamientos. Se generó un gráfico MDS utilizando coeficientes biológicos de variación (BCV) a partir de recuentos de transcripciones para cada muestra aislada. Las muestras de cada grupo se agrupan bien, aparte de las muestras de Edge, y las colonias de fénix y las colonias similares a VBNC se superponen considerablemente. Las muestras de césped de control, bordes y exteriores se agrupan por sí solas y por separado de las muestras tipo Phoenix y VBNC.

Gráficos de volcanes de DEG. (A) La comparación de los recuentos de transcripciones de colonias de fénix con los recuentos de transcripciones de control del césped mostró 63 DEG. (B) La comparación de los recuentos de transcritos de colonias similares a VBNC con los recuentos de transcritos de control del césped mostró 90 DEG. (A, B) Los puntos rojos indican transcripciones de genes que estaban significativamente reguladas al alza (cambio mayor al doble y valor p corregido de 0,05 o menos). Los puntos azules indican transcripciones de genes que estaban significativamente reguladas a la baja (cambio de más del doble y valor de p corregido de 0,05 o menos). Los puntos negros indican genes sin diferencias significativas en la transcripción.

Se examinaron mutantes de transposones, de la biblioteca de mutantes de transposones de P. aeruginosa de Colin Manoil15, para cada DEG, en busca de cambios en la frecuencia de aparición de colonias de fénix. Nueve DEG no tenían un mutante de transposón correspondiente disponible en la biblioteca para su detección (Tabla 1). Debido a la naturaleza integral de la biblioteca de transposones de Manoil, estos nueve genes probablemente sean esenciales. Sin embargo, el transposón mutante para PA3626 produjo una falta total de aparición de colonias de fénix cuando se expuso a tobramicina (n = 6). PA3626 codifica la pseudouridina sintasa D (TruD)16. La complementación del gen PA3626 completo en el mutante del transposón PA3626, utilizando un plásmido pUCP18:PA3626, restauró la frecuencia de formación de colonias de fénix a niveles de tipo salvaje (Fig. 5), lo que indica la importancia de TruD en la aparición de colonias de fénix.

La complementación de PA3626 muestra el rescate del fenotipo fénix. Se obtuvieron recuentos de colonias de Phoenix para P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje, el mutante del transposón PA3626 y la cepa de complementación PA3626. Después de la complementación del transposón mutante, los recuentos de colonias de Phoenix volvieron a los niveles de tipo salvaje, lo que confirma aún más la importancia del ARNt pseudouridina sintasa D en la aparición de colonias de Phoenix. *p < 0,05, **p < 0,01, n = 3.

Dado que las colonias de fénix parecen surgir solo en presencia de aminoglucósidos9, se realizaron pruebas adicionales usando tetraciclina, un inhibidor de la unión del ARNt al sitio P del ribosoma, y ​​cloranfenicol, un inhibidor de la elongación del péptido. Ni la tetraciclina ni el cloranfenicol mostraron la aparición de colonias de fénix dentro de la ZOC, lo que indica además que las colonias de fénix son un fenómeno específico de aminoglucósidos.

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano importante implicado en infecciones tanto superficiales como potencialmente mortales que ha desarrollado fácilmente tolerancia y resistencia a múltiples fármacos antibacterianos. En este estudio, se examinaron tanto los genomas como los transcriptomas de las colonias Phoenix y de las colonias similares a VBNC. Se utilizó la secuenciación del genoma completo con combinación de muestras para identificar mutaciones conductoras conservadas. Si bien los aislados similares a VBNC muestran un fenotipo diferente al de P. aeruginosa de tipo salvaje, ambos fenotipos eran genotípicamente idénticos. Sin embargo, en comparación con P. aeruginosa de tipo salvaje, las colonias de Phoenix tienen un SNP en el gen PA4673 que se predice que codifica una proteína de unión a GTP similar a YchF en S. pombe13,14. Este SNP conduce a una modificación de la estructura de la proteína en una región externa del gen y posiblemente podría conducir a un cambio en un sitio de unión. Las proteínas de unión a GTP, también conocidas como proteínas G, son interruptores moleculares que hidrolizan el GTP a GDP y están unidas a la membrana para permitir que estímulos extracelulares estimulen los efectos posteriores17. Una modificación en la capacidad de una proteína G para unirse a un sustrato puede tener un impacto importante en los efectores posteriores dentro de la vía y puede permitir que las colonias de fénix toleren transitoriamente la presencia de altas concentraciones de antibióticos.

Transcripcionalmente, se encontró que tanto las colonias de fénix como las colonias similares a VBNC se agrupaban por separado de las células en la biopelícula de césped de control que no habían sido expuestas a antibióticos, el borde de la ZOC y los controles de césped de fondo exterior, mientras se agrupaban bien entre sí. Es interesante que tanto las colonias de Phoenix como las colonias similares a VBNC sean transcriptómicamente similares entre sí a pesar de aparecer como dos fenotipos distintos. Es posible que las colonias similares a VBNC puedan ser un subconjunto de colonias de fénix que carecen de la capacidad de cultivarse debido a la dependencia de un metabolito en el entorno inicial, ya sea del césped de biopelícula original o de las colonias variantes circundantes. También es interesante observar que no se encontraron cambios significativos en las vías metabólicas en las colonias de fénix o colonias similares a VBNC que pudieran explicar la tolerancia a los antibióticos exhibida por estos fenotipos. Esto contrasta los fenotipos de tolerancia típicos que se encuentran en P. aeruginosa, incluidas las células persistentes, las variantes de colonias pequeñas y las colonias de resistencia adaptativa, que entran en un estado de latencia, tienen defectos de crecimiento o están impulsadas metabólicamente de otra manera10,18,19,20,21,22 .

Tras un examen más detenido de los DEG asociados con las colonias de fénix, se encontró un gen que cuando se analizó mostró una falta de emergencia de colonias de fénix: PA3626, que codifica el ARNt pseudouridina sintasa D (TruD). La tobramicina, el antibiótico asociado con la aparición de las colonias de fénix9, es un aminoglucósido. Los aminoglucósidos se unen irreversiblemente a la porción 30S del ribosoma bacteriano, lo que lleva a una unión incorrecta del ARNt al ARNm debido a un impedimento estérico durante la traducción23. La resistencia a los antibióticos a los aminoglucósidos se puede conferir mediante la modificación del sitio diana ribosomal24. Además, se ha demostrado que los aminoglucósidos también interactúan directamente con el ARNt y pueden provocar una pérdida de interacción entre los bucles T y D, así como el desarrollo del tallo D25,26. TruD convierte el uracilo-13 en el bucle D en pseudouridina, lo que puede influir en la forma en que los aminoglucósidos pueden interactuar con el ARNt27. La eliminación de TruD mediante mutagénesis de transposones condujo a la eliminación de la aparición de colonias de fénix que pudieron rescatarse a niveles de tipo salvaje mediante complementación de plásmidos. Este hallazgo es interesante porque nos lleva a creer que, además del ribosoma, la tobramicina también puede estar interactuando con el ARNt, lo que provoca la muerte celular. Es posible que las colonias de Phoenix estén modificando su ARNt con TruD para aumentar la estabilidad del ARNt y permitir la supervivencia con la exposición a la tobramicina, aunque esto es algo a lo que será necesario realizar un seguimiento para confirmarlo. Además, existe un conflicto entre los niveles de expresión de PA3626 (regulados negativamente) y los datos de desactivación de PA3626 que indicaron que PA3626 es necesario para la aparición de colonias de fénix. Una mayor investigación y comprensión de PA3626 y sus sitios objetivo pueden ayudar a aclarar estos resultados contradictorios y proporcionar información sobre los mecanismos involucrados.

Se necesita más investigación, incluida la exploración epigenética, para llegar a una comprensión completa tanto de las colonias de fénix como de las colonias similares a VBNC. Al comprender cómo estos y otros fenotipos bacterianos pueden sobrevivir en presencia de antibióticos, estaremos mejor preparados para controlar el aumento de infecciones tolerantes y resistentes a los antibióticos.

Para la parte de imágenes de este estudio se utilizó la cepa bioluminiscente P. aeruginosa Xen41 (Xenogen Corp., EE. UU.) (Fig. 1). P. aeruginosa Xen41 contiene un operón lux impulsado metabólicamente que permite la visualización mediante IVIS e indica el nivel de actividad metabólica del césped y las colonias bacterianas, ya que un aumento de la luminiscencia se correlaciona con un aumento de la actividad metabólica bacteriana. En este estudio también se utilizó P. aeruginosa PAO115, la cepa original de P. aeruginosa Xen41. Las placas de cultivo madre se prepararon mediante estrías de cultivos madre de glicerol que se almacenaron a -80 °C en placas de agar Luria-Bertani (LB) frescas. Las placas rayadas se incubaron a 37 °C durante 24 h. Se aislaron colonias individuales y se transfirieron a 20 ml de caldo LB. Los cultivos en caldo se incubaron durante la noche en una incubadora con agitación a 37 °C y 200 rpm.

Se utilizaron 240 mg de tobramicina (Sigma-Aldrich) por 20 g de CaSO4 hemihidrato (Sigma-Aldrich)28. Después de mezclar los dos polvos, se mezcló agua esterilizada para producir una pasta espesa. La pasta se extendió en moldes de silicona (Biocomposites Ltd.) para formar perlas semiesféricas de 4,5 mm de diámetro. Las perlas se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche antes de retirarlas del molde y almacenarlas a 4 °C. Además, se fabricaron perlas que contenían tetraciclina (960 mg/20 g CaSO4) y cloranfenicol (3,8 g/20 g CaSO4).

Las colonias de Phoenix se obtuvieron según Sindeldecker et al.9. Brevemente, se diluyó un cultivo nocturno de P. aeruginosa PAO1 hasta una DO600 de 0,1 utilizando caldo LB estéril. Se esparcieron cien µl del cultivo diluido sobre agar LB en placas de poliestireno de 100 mm de diámetro (Fisher Scientific, EE. UU.). Las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h en una incubadora humidificada (Heracell 150i, Thermo Scientific) para permitir que se desarrollara una biopelícula de césped. Se colocó una perla de sulfato de calcio cargada con tobramicina en el centro de la placa y se empujó hacia el interior del agar con unas pinzas estériles. Luego, las placas se incubaron más a 37 °C con 5% de CO2 durante 96 h más. Las placas se revisaron diariamente para detectar la aparición de una zona de aclaramiento (ZOC), así como colonias que emergían dentro de esta zona. Además, se prepararon biopelículas de césped de 72 h de la misma manera pero sin perlas de tobramicina para usar como césped de control.

Se aislaron colonias de Phoenix, colonias similares a VBNC y colonias PAO1 de P. aeruginosa de tipo salvaje para la secuenciación del genoma completo. En resumen, las placas de colonias de fénix se generaron como se indicó anteriormente. Después de la aparición de las colonias variantes en tres placas replicadas, se aislaron 96 colonias de cada placa en alícuotas de 100 µl de PBS y se almacenaron a -20 °C. Antes de colocar las muestras a -20 °C, se utilizaron 5 µL para inocular 200 µL de caldo LB que contenía 5 µg/mL de tobramicina en un pocillo de una placa de 96 pocillos (Corning, Sigma-Aldrich). Se agregaron 5 µl adicionales al pocillo correspondiente que contenía 200 µl de caldo LB. Las placas se incubaron durante 96 h a 37 °C con 5% de CO2. Después de la incubación, se comparó visualmente la turbiedad en los pocillos. Las variantes que mostraron una falta de crecimiento en el caldo LB así como el correspondiente pocillo de caldo LB que contenía tobramicina se definieron como colonias similares a VBNC. Las colonias Phoenix se definieron como aquellas que mostraban una falta de crecimiento en el caldo LB que contenía tobramicina mientras que sólo tenían crecimiento en el LB. También se cultivó un cultivo en caldo durante la noche de P. aeruginosa PAO1 como se indicó anteriormente para proporcionar una muestra de tipo salvaje para la extracción de ADN.

Los aislados que crecieron a partir de la sección anterior se sometieron a un ensayo de Kirby-Bauer para confirmar si eran resistentes o susceptibles a la tobramicina. Cada aislado se diluyó hasta una DO600 de 0,1. Se esparcieron 100 µl de cada cultivo diluido en placas de agar LB. Se colocó un disco de papel de filtro estéril en el centro de cada placa y se colocaron 10 µg de una solución de tobramicina (1 mg/ml en PBS) en cada disco. Las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Después de la incubación, se midió el diámetro de la zona de inhibición y se comparó tanto con WT P. aeruginosa PAO1 como con las pautas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para determinar si eran resistentes o susceptibles (colonias de fénix). Se seleccionaron al azar cuatro colonias de fénix y cuatro colonias similares a VBNC para la extracción de ARN.

La extracción de ADN se realizó para cada una de las muestras aisladas utilizando el kit de ADN genómico bacteriano GenElute™ (Sigma-Aldrich). Después de la extracción de ADNg, las muestras se agruparon para obtener muestras de 400 ng de ADNg para identificar mutaciones conductoras conservadas. La preparación de la biblioteca y los códigos de barras se completaron utilizando el kit Rapid Barcoding (Nanopore). Se utilizó un secuenciador Nanopore MinION para completar la secuenciación del genoma bacteriano completo utilizando la configuración predeterminada. Después de la secuenciación, el control de calidad se realizó utilizando Epi2ME (Nanopore). Las lecturas se recortaron usando Porechop29 y se alinearon con un genoma PAO1 de P. aeruginosa de referencia (GCF_000006765.130) usando Graphmap31. Las lecturas se ordenaron e indexaron utilizando samtools32. Las variantes estructurales se identificaron mediante sniffles33 y los SNP se identificaron mediante BCFtools34. Los SNP se seleccionaron mediante un puntaje de calidad> 20.

Una vez que se prepararon las placas de colonias de fénix, se tomaron muestras para usar en la secuenciación de ARN. Setenta y dos horas después de la colocación de las perlas de tobramicina, se tomaron muestras por triplicado del césped en el borde de la ZOC, donde las colonias variantes, incluidas las colonias fénix, las colonias similares a VBNC y las colonias resistentes, serían visibles al día siguiente. Las muestras de borde probablemente contenían precursores de las colonias variantes, células WT y células muertas y moribundas. Noventa y seis horas después de la colocación de las perlas de tobramicina, se tomaron muestras por triplicado del césped del fondo exterior y se aislaron colonias variantes que habían surgido en la ZOC para la caracterización del fenotipo (colonias fénix, colonias similares a VBNC o mutantes resistentes). Además, se tomaron muestras por triplicado de céspedes bacterianos cultivados durante 72 h que no habían estado expuestos a antibióticos. Todas las muestras se colocaron en 100 µl de RNAlater (Ambion) y se almacenaron a -20 °C para proteger el ARN de la degradación. Para los aislados de colonias variantes, se tomó una muestra de 5 µL y se usó para inocular 15 ml de caldo LB estéril y se incubó a 37 °C con agitación de 200 rpm durante la noche. Los cultivos que no crecieron se consideraron colonias similares a VBNC. Los cultivos que crecieron se examinaron más a fondo para determinar su nivel de susceptibilidad a la tobramicina.

La extracción de ARN se realizó para cada muestra utilizando el kit Direct-zol RNA Miniprep (Zymo), incluido el tratamiento con ADNasaI para la eliminación del ADN. La cantidad de ARN se midió utilizando Qubit 3.0. Para eliminar el ARN ribosómico se utilizó el kit RiboZero Bacteria (Illumina). Se generaron bibliotecas de RNAseq con códigos de barras utilizando el kit ScriptSeq™ v2 (Illumina) y se diluyeron 38 fmol de ARN hasta una concentración final de 1,9 nM en tampón de resuspensión utilizando cantidades iguales de ARN de cada muestra para la normalización. Las muestras se secuenciaron mediante secuenciación de extremos emparejados (2 × 150 pb) en un dispositivo Illumina HiSeq 4000. Las lecturas de secuenciación se recortaron con Trimmomatic v0.3835, se controlaron la calidad con FastQC v0.11.836 y se asignaron al genoma de referencia de P. aeruginosa PAO1 (GCF_000006765.130) con STAR v2.7.10a37. Después de leer el mapeo, se visualizaron las secuencias para garantizar una cobertura adecuada del genoma utilizando IGV (v2.4.1338). Los recuentos de transcripciones se obtuvieron utilizando HTseq v0.12.439 y se analizaron para determinar la expresión genética diferencial utilizando el paquete R edgeR (v3.24.340). Se generaron gráficos de escala multidimensional utilizando la función plotMDS dentro de edgeR. Los gráficos de volcanes se generaron utilizando la función ggplot2 en R41. Los genes que se expresaron diferencialmente al comparar muestras de colonias de fénix y colonias similares a VBNC con muestras de césped no expuestas durante 72 h se enviaron a DAVID 6.842,43, KEGG44 y Gene Ontology45,46 para su análisis.

Los mutantes de transposones (obtenidos del laboratorio del Dr. Colin Manoil15) correspondientes a cada uno de los genes expresados ​​diferencialmente identificados se analizaron en réplicas por triplicado para determinar su capacidad de producir colonias de fénix de la misma manera que anteriormente. Las colonias de Phoenix se distinguieron utilizando réplicas en placas según Sindeldecker et al.9. Brevemente, se colocó un cuadrado de pana de algodón estéril (150 × 150 mm) sobre un bloque de revestimiento de réplica de PVC y se mantuvo en su lugar mediante un anillo de aluminio. La perla de tobramicina se retiró de la placa utilizando un asa de plástico estéril. Se marcó la placa para indicar la posición de las 12 en punto y se colocó suavemente sobre el cuadrado de pana. La placa se golpeó suavemente antes de retirarla de la réplica. Una placa de agar LB nueva y estéril que contenía 5 μg/ml de tobramicina y marcada en la posición de las 12 en punto se colocó sobre el cuadrado de pana y se golpeó de la misma manera antes de retirarla. Se colocó una placa de agar LB nueva y estéril marcada en la posición de las 12 en punto sobre el cuadrado de pana y se golpeó ligeramente antes de retirarla. Las placas réplica se incubaron durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2. Después de la incubación, se comparó el patrón de colonias y se determinó que las colonias que aparecían en la placa de réplica de agar LB pero no en la placa de réplica de agar LB que contenía tobramicina eran colonias de fénix. Se obtuvieron recuentos de colonias de fénix mutantes de transposones y se compararon con recuentos de control de P. aeruginosa PAO1. El mutante del transposón para PA3626 no mostró ninguna aparición de colonias de fénix y se realizó un control para garantizar que esta falta de aparición no se debiera a un defecto de crecimiento del mutante. Tanto WT P. aeruginosa PAO1 como el mutante del transposón PA3626 se sembraron en placas y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO2 durante 24 h. Después de la incubación, se aislaron áreas de 1 cm x 1 cm y se creó una serie de diluciones, se sembró en placas y se incubó a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h. Se obtuvieron recuentos de UFC para cada cultivo (3,0 × 108 UFC/cm2 para WT y 7,0 × 108 UFC/cm2 para el mutante) y se compararon (p = 0,34).

El ADNg de PAO1 de Pseudomonas aeruginosa se extrajo utilizando el kit de ADN genómico bacteriano GenElute™. Después de la extracción, se realizó una PCR para amplificar el gen PA3626 utilizando la polimerasa Phusion Taq (New England Biolabs) y cebadores directos (5′-GCGCGGATCCATGAGCGTTCTCGGCGAA) e inversos (5′-GCGCTCTAGATCAGTATGCGCATGGGTT) (Integrated DNA Technologies). Después de la amplificación, el producto PA3626 se ejecutó en un gel de agarosa y se extrajo utilizando el kit de extracción en gel GenElute™. Se completó una digestión de ADN usando las enzimas de restricción BamHI y XbaI (New England Biolabs) en el producto PA3626 y el plásmido pUCP18. La ligadura del ADN se completó utilizando la ADN ligasa T4 (Thermo Fisher) y una proporción de inserto a plásmido de 7:1. Después de la ligación, el plásmido se electroporó en P. aeruginosa PAO1 PA3626::Tn5. Brevemente, se centrifugó 1 ml de un cultivo nocturno de PAO1 PA3626::Tn5 a velocidad máxima en una microcentrífuga durante 1 min. El sedimento se lavó tres veces en sacarosa al 10% en agua esterilizada antes de resuspenderse en 100 µl de sacarosa al 10%. Se añadieron 5 µl del plásmido ligado y la mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 2 mm. La cubeta se electroporó a 25 µF, 200 Ω y 2,5 kV. Se añadió 1 ml de LB estéril a la cubeta y el cultivo se transfirió a un tubo de 1,5 ml y se incubó a 37 °C con agitación de 200 rpm durante 1 h. Después de la incubación, el cultivo se extendió sobre agar LB que contenía 100 µg/ml de carbenicilina y se incubó durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. Los aislados se cultivaron y los plásmidos se extrajeron utilizando el kit Qiagen Spin Miniprep. Los plásmidos se digirieron usando las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y se ejecutó un gel de agarosa para confirmar que estaban presentes las bandas del tamaño apropiado.

La cepa de complementación PA3626 se sembró en placas y se expuso a 1 mg de tobramicina como se indicó anteriormente. Después de la aparición de colonias variantes, las placas se sembraron de manera replicada en agar LB fresco y agar LB que contenía 5 µg/ml de tobramicina. Las placas réplica se incubaron durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2. Después de la incubación, las placas se compararon entre sí y las colonias que crecieron en la placa original y en la placa réplica solo de LB pero que no crecieron en la placa réplica que contenía tobramicina se contaron como colonias fénix.

Las secuencias de aminoácidos para PA4673 y PA4673 de tipo salvaje que contienen el SNP identificado se enviaron para la estructura de la proteína y el modelado funcional a Phyre2 en un servidor de desarrollo interno12 utilizando el modo de modelado intensivo. Los modelos se visualizaron utilizando RasMol47. Además, las secuencias de aminoácidos para PA4673 tanto de tipo salvaje como mutante se enviaron al servidor ExPASy48.

Todos los experimentos se realizaron con un mínimo de réplicas técnicas por triplicado. El análisis ANOVA se completó en edgeR para genes expresados ​​diferencialmente con una significación establecida en un valor q de 0,05. GraphPad Prism (v8.2.1) completó el análisis ANOVA para todos los demás estudios, considerándose significativo un valor de p de 0,05.

Las imágenes de bioluminiscencia se realizaron utilizando un sistema de imágenes in vitro (IVIS). Las placas se expusieron durante treinta segundos para obtener imágenes. Se aplicó un mapa de calor de pseudocolor para ayudar en la visualización.

Los datos sin procesar de la secuenciación de ARN junto con los recuentos de genes procesados ​​para cada muestra están disponibles a través de Gene Expression Omnibus, acceso GSE199323. Las lecturas de secuenciación sin procesar de la secuenciación del genoma completo están disponibles a través de Sequence Read Archive, acceso PRJNA820154.

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Este trabajo fue financiado en parte por la Facultad de Medicina de la Universidad Estatal de Ohio y R01 NIH-GM124436 (PS), R01AI148788 (MZA), un premio NSF CAREER Award 2046863 (MZA), la subvención de la American Heart Association AHA 20PRE35200201 (MJD), NIH GM132254 (JDA) y NIH GM084065-11 (JDA). Nos gustaría agradecer al recurso compartido de genómica del Centro Integral del Cáncer de la Universidad Estatal de Ohio por realizar la secuenciación del ARN. También nos gustaría agradecer a Robert Fillinger por la asistencia técnica con el análisis de datos de RNAseq. Además, nos gustaría agradecer al laboratorio del Dr. Daniel Wozniak por proporcionar cepas de sus existencias de la biblioteca de transposones de P. aeruginosa del Dr. Colin Manoil.

Departamento de Inmunidad y Infección Microbiana, Universidad Estatal de Ohio, 760 BRT, 460 West, 12th Avenue, Columbus, OH, 43210, EE. UU.

Devin Sindeldecker, Matthew Anderson y Paul Stoodley

Departamento de Microbiología, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Matthew Dunn, Aubree Zimmer, Matthew Anderson y Juan Alfonzo

Programa de Bioquímica del Estado de Ohio, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Habitación Aubree

Departamento de Ortopedia, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Pablo Stoodley

Centro Nacional de Tribología Avanzada de Southampton (nCATS), Ingeniería Mecánica, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

Pablo Stoodley

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DS escribió el texto principal del manuscrito y preparó las figuras. DS, MD y AZ fueron responsables de la recopilación y el análisis de datos. MA, JA y PS fueron responsables de la administración del proyecto y brindaron apoyo financiero. Todos los autores participaron en la concepción del proyecto y el diseño experimental. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Devin Sindeldecker.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sindeldecker, D., Dunn, M., Zimmer, A. y col. Perfiles genómicos y transcriptómicos de colonias de fénix. Informe científico 12, 13726 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18059-1

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Recibido: 06 de junio de 2022

Aceptado: 04 de agosto de 2022

Publicado: 12 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18059-1

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